樣品中強(qiáng)保留物質(zhì)逐漸在色譜柱中積累造成高效液相色譜儀色譜柱的污染，情況嚴(yán)重的直接造成色譜柱報(bào)廢。
為延長色譜柱的使用壽命，常用到的方法是色譜柱保護(hù)與再生。
高效液相色譜儀色譜柱在色譜分析系統(tǒng)中主要起著分離檢測(cè)物質(zhì)的作用，如同色譜系統(tǒng)的心臟，同時(shí)也是易損耗品。
色譜柱在吸附樣品時(shí)，樣品中所含有的鹽、脂質(zhì)、疏水蛋白質(zhì)和其它一些生物物質(zhì)都有可能與色譜柱發(fā)生相互作用，一些保留值較小的物質(zhì)如鹽類比較容易被沖出色譜柱，而一些保留性較強(qiáng)的組分，流動(dòng)相溶液不足以把這些物質(zhì)洗脫下來，多次上樣后，這些吸附在柱子表面的物質(zhì)通常就會(huì)積累在柱頭。
當(dāng)這些被吸附的樣品成分累積到一定程度足以使之形成新的固定相而改變分離機(jī)理，以致樣品保留時(shí)間會(huì)波動(dòng)，會(huì)出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。
色譜柱結(jié)構(gòu) 1-塑料保護(hù)堵頭；2-柱頭螺絲；3-刃環(huán)(卡套)；4-聚四氟乙烯O形圈；5-多孔不銹鋼燒結(jié)片；6-色譜柱管；7-液相色譜固定相
色譜柱保護(hù)
為了延長色譜柱的使用壽命，前面已經(jīng)指出，應(yīng)在分析柱前連接一個(gè)小體積的保護(hù)柱。保護(hù)柱是內(nèi)徑為1.0mm、2.1mm、3.2mm、4.6mm或10mm、20mm、40mm，長7.5mm、10mm或20～60mm的短填充柱，通常填充和分析柱相同的填料(固定相)，可看作是分析柱的縮短形式，安裝在分析柱前。
其作用是收集、阻斷來自進(jìn)樣器的機(jī)械和化學(xué)雜質(zhì)，以保護(hù)和延長分析柱的使用壽命。一只1cm長的保護(hù)柱就能提供充分的保護(hù)作用。若選用較長的保護(hù)柱，可降低污染物進(jìn)入分析柱的機(jī)會(huì)，但會(huì)引起譜帶擴(kuò)張。因此選擇保護(hù)柱的原則是在滿足分離要求的前提下，盡可能選擇對(duì)分離樣品保留低的短保護(hù)柱。
保護(hù)柱也可裝填和分析柱不同的填料，如較粗顆粒的硅膠(10～15um)或聚合物填料，但柱體積不宜過大，以降低柱外效應(yīng)的影響。
保護(hù)柱裝填的填料較少，價(jià)格較低，其為消耗品，通?？煞治?0～100次樣品，柱壓力降呈現(xiàn)增大的趨向就是需要更換保護(hù)柱的信號(hào)。
現(xiàn)在市場供應(yīng)的結(jié)構(gòu)新穎可更換柱芯式設(shè)計(jì)的保護(hù)柱，由保護(hù)柱套和可更換式保護(hù)柱芯兩部分組成。
保護(hù)柱與分析柱的連接示意圖
1-保護(hù)柱套；2-保護(hù)柱芯；3-PEEK標(biāo)準(zhǔn)通用接頭；4-分析柱接頭；5-連接六通進(jìn)樣閥接頭
對(duì)硅膠基體的鍵合固定相，流動(dòng)相的pH值應(yīng)保持在2.5～7.0之間。具有極端值的流動(dòng)相會(huì)溶解硅膠，而使鍵合相流失。
使用水溶性流動(dòng)相時(shí)，為防止微生物繁殖引起柱阻塞，應(yīng)加入0.01％的疊氮化鈉，以抑制微生物的繁殖。對(duì)不潔凈的樣品，要使用0.45um濾膜過濾或經(jīng)固相萃取器凈化后再進(jìn)樣。
進(jìn)行正式分析前，應(yīng)先用10倍柱體積的流動(dòng)相沖洗色譜柱，以保持色譜柱處于平衡狀態(tài)。當(dāng)使用乙醇、異丙醇、乙酸等黏度大的流動(dòng)相時(shí)，色譜柱的平衡時(shí)間要延長，甚至要加倍。
對(duì)反相C18 鍵合相柱，除去柱中含有的緩沖溶液鹽類或水溶性物質(zhì)時(shí)，不應(yīng)使用純水沖洗。因?yàn)镃18鍵合相像一條長鏈將硅膠黏結(jié)，當(dāng)有有機(jī)溶劑存在時(shí)，其表面被流動(dòng)相潤濕，C18長鏈完全展開，像海水中的海藻一樣。當(dāng)純水或緩沖溶液通過時(shí)，C18鍵合相與其不浸潤，鍵合相表面會(huì)塌陷，從而將溶劑、樣品分子或無機(jī)鹽分子包合。此時(shí)僅用純水無法將包合物洗脫出，應(yīng)使用含5％有機(jī)溶劑的水溶液沖洗，才可清除無機(jī)鹽或水溶性物質(zhì)。
硅膠、氧化鋁或正相鍵合相柱，應(yīng)保存在流動(dòng)相中。氰基柱不能保存在純有機(jī)溶劑(如甲醇或乙腈)中，應(yīng)保留在欲使用的流動(dòng)相中；氨基柱最好保存在乙腈中，而非流動(dòng)相，并且應(yīng)注意不可使用丙酮作流動(dòng)相。C18反相柱應(yīng)保存在純甲醇溶劑中，對(duì)填充高交聯(lián)度苯乙烯-二乙烯基苯共聚微球的非極性固定相也可用此法保存。
色譜柱再生
對(duì)使用時(shí)間較長、柱效逐漸下降的色譜柱，可用下述方法進(jìn)行快速再生，以除去微量不潔雜質(zhì)在柱頭的聚積。
正相柱：用下述極性強(qiáng)且能互溶的有機(jī)溶劑來洗滌色譜柱，每種溶劑每次用30mL清洗，按庚烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮(氨基柱不用)、甲醇、5％甲醇水溶液次序沖洗(洗脫劑的極性依次遞增)，最后再用純甲醇通過柱將水分帶出，拆下柱置于氣相色譜儀柱箱中升溫至75℃，以除去水分。另應(yīng)注意不能使用乙醇，它會(huì)使柱喪失柱效。
反相柱：用極性溶劑每種30mL，按以下順序清洗：5％甲醇水溶液、0.5mol/L H3PO4(或0.1mol/L EDTA鈉鹽)、5％甲醇水溶液、甲醇、甲醇-氯仿(1：1)混合液、甲醇、5％甲醇水溶液。最后保存在甲醇溶劑中。
當(dāng)色譜柱的性能變得很差時(shí)，可采用下述兩種方法，作最后的補(bǔ)救。
一種方法是修補(bǔ)柱頭并同時(shí)更換不銹鋼燒結(jié)片。當(dāng)取下燒結(jié)片發(fā)現(xiàn)柱頭塌陷或填料被雜質(zhì)污染時(shí)，可挖掉0.5mm左右的固定相，再重新填充同樣的干燥固定相，用少量流動(dòng)相潤濕，再填充干燥的固定相與柱口平齊(必要時(shí)用光滑的不銹鋼棒壓緊)，如此重復(fù)3～5次。
再換上新的不銹鋼燒結(jié)過濾片，擰緊結(jié)頭，與高壓泵連接，用流動(dòng)相沖洗20min，若柱壓力降恢復(fù)正常，可連接檢測(cè)器，測(cè)柱效。若柱效恢復(fù)就可繼續(xù)使用。若柱壓力降恢復(fù)正常，但柱效仍偏低，表明柱頭未填充緊密，仍有空隙，此時(shí)應(yīng)重復(fù)上述操作，直至柱壓力降恢復(fù)正常、柱效也恢復(fù)正常才可繼續(xù)使用。
另一種方法是倒沖色譜柱。此法適用于已修補(bǔ)過柱頭，柱壽命已達(dá)中后期的色譜柱。柱逆向使用后柱效會(huì)損失較大(約30％)，倒沖柱可檢查柱頭不銹鋼燒結(jié)片是否堵塞。若已堵塞在倒沖柱時(shí)，可觀察到柱壓力降減小，待柱壓力降恢復(fù)正常，再將色譜柱按原方向安裝使用。
柱的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)
色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要，稍有不慎就會(huì)降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護(hù)色譜柱。 1、避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過緩。 2、應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然，流?dòng)相使用前必須經(jīng)脫氣和過濾處理。 3、一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì)迅速降低柱效。 4、選擇使用適宜的流動(dòng)相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時(shí)，預(yù)柱為硅膠，可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解，壓力升高是需要更換預(yù)柱的信號(hào)。 5、避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處 理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。 6、經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時(shí)，對(duì)流路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要50～75ml。
7、避免使用高粘度的溶劑作為流動(dòng)相；如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動(dòng)相，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)完畢柱子沖洗干凈。8、進(jìn)樣樣品要提純； 9、嚴(yán)格控制進(jìn)樣量，不要超載。 10、每天分析測(cè)定結(jié)束后，都要用適當(dāng)?shù)娜軇﹣砬逑粗?，最好用洗脫能力?qiáng)的洗脫液沖洗，例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當(dāng)采用鹽緩沖溶液作流動(dòng)相時(shí)，使用完后應(yīng)用無鹽流動(dòng)相沖洗。含鹵族元素（氟、氯、溴）的化合物可能會(huì)腐蝕不銹鋼管道，不宜長期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經(jīng)常使用，應(yīng)每隔4~5天開機(jī)沖洗15分鐘。 11、大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是2－7.5，盡量不超過該色譜柱的pH范圍。 12、按說明書保存色譜柱，絕對(duì)禁止講緩沖液留在柱內(nèi)過夜，注意反相柱不能用純水長時(shí)間沖。 13、不建議拆開柱子，自己更換填料。
