蛋白質(zhì)氧化 - 蛋白質(zhì)和多肽反相HPLC分析和純化指南

在氧化環(huán)境條件下，盡管蛋白質(zhì)的幾個(gè)氨基酸都可能受影響，但最有可能被氧化的氨基酸是甲硫氨酸；甲硫氨酸可被氧化成甲硫氨酸亞砜（圖34）。
對(duì)甲硫氨酸殘基的氧化取決于其在蛋白質(zhì)中的位置。埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的甲硫氨酸不可能被氧化。接近表面且與溶劑接觸的甲硫氨酸側(cè)鏈最有可能被氧化。
氧化條件包括熱、過渡金屬的存在以及溶液中氧氣的存在。
同脫酰胺作用一樣，甲硫氨酸的氧化可能導(dǎo)致生物活性的喪失或減弱，或者，在一些情況下對(duì)生物活性無影響。
這取決于甲硫氨酸在蛋白質(zhì)中的位置。但另一方面，甲硫氨酸亞砜的存在說明蛋白質(zhì)經(jīng)受過氧化條件，因此甲硫氨酸氧化可以指示蛋白質(zhì)經(jīng)受過脅迫條件。

圖34. 在氧化環(huán)境條件下，甲硫氨酸被氧化為甲硫氨酸亞砜。

圖35. 天然蛋白水解產(chǎn)生的重組人凝血因子VIIa的一氧化物和二氧化物的反相色譜法分離。

條件

色譜柱：C4 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米

流動(dòng)相：37~47% 乙腈-0.1% TFA體系，30分鐘梯度洗脫。

樣品：被過氧化氫部分氧化的重組人凝血因子 VIIa。

通常會(huì)監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)治療藥物的氧化反應(yīng)，因?yàn)樗瓤赡苡绊懮锘钚裕部勺鳛橐环N指示。
甲硫氨酸的氧化反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水性下降，因此在反相HPLC中，氧化蛋白會(huì)先于天然蛋白洗脫出來，如圖35所示。
重組人凝血因子VIIa（rCF VIIa）被過氧化氫部分氧化后利用反相HPLC對(duì)溶液進(jìn)行分析。
氧化蛋白（兩個(gè)甲硫氨酸殘基被氧化）先洗脫出來。
只有一個(gè)甲硫氨酸被氧化的兩種蛋白隨后洗脫出來，最后是天然蛋白。四種蛋白具有良好的分辨率。
尤其是只有一個(gè)甲硫氨酸被氧化的兩種蛋白間分辨率很高。這幾種蛋白均有一個(gè)氧化甲硫氨酸，僅區(qū)別于被氧化甲硫氨酸的不同。

通常利用肽圖監(jiān)測(cè)甲硫氨酸的氧化。
如圖36所示，含氧化甲硫氨酸的多肽比含天然甲硫氨酸的多肽出峰時(shí)間早很多。
T2 metox 先于天然T2胰蛋白酶水解片段洗脫出來；T11 metox先于天然 T11洗脫出來，使得鑒別和監(jiān)測(cè)更容易。

圖36. 部分氧化的人生長激素的肽圖。

條件

色譜柱：C18寬孔柱，4.6 x 250 mm

流動(dòng)相：0~40% 乙腈—0.1% TFA體系，梯度洗脫，120分鐘。